- Preparación de células competentes
- Cultive una cepa de Agrobacterium con los antibióticos adecuados en 5 ml de medio LB durante la noche a 28°C.
- Añada 2 ml del cultivo de una noche a 50 ml de medio LB e incube a 28°C hasta que el cultivo alcance una OD600 de 0,5 a 1,0
- Enfríe el cultivo en hielo. Centrifugue la suspensión celular a 3000 g durante 5 min a 4°C.
- Descarte el sobrenadante. Resuspenda las células en 1 ml de solución de CaCl2 20 mM (enfriada en hielo). Reparta alícuotas de 0,1 ml en tubos Eppendorf de 2 ml.
- Congele las células en nitrógeno líquido y guárdelas a -80°C, o úselas directamente para la transformación.
- Transformación de Agrobacterium con vectores binarios
- Descongele las células competentes con cuidado, en hielo
- Añada 0,1-1 µg de ADN a las células y mezcle.
- Congele las células a -80°C
- Descongele las células incubándolas en un baño de agua a 37°C durante 5 min.
- Mantenga las células en hielo durante 30 min.
- Siembre las células en placas de LB precalentadas (28°C) que contengan todos los antibióticos adecuados
- Tras 2 días de incubación a 28°C aparecen unas 20-100 colonias.
- Selección con antibióticos
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Rifampicina 100 µg/ml |
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Gentamicina 50 µg/ml, Kanamicina 50 µg/ml |
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Espectinomicina 100 µg/ml, Estreptomicina 300 µg/ml |